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土壤微生物固碳酶提取的方法

來源：admin2022/12/25 14:23:03瀏覽：/次

　　一種土壤微生物固碳酶提取的方法,其步驟是：

A、土壤樣品的預(yù)處理：a、稱取新鮮土樣于無菌離心管中；b、加5倍體積預(yù)冷的土壤各種離子、無機(jī)物以及有機(jī)物,胞外游離的蛋白去除劑渦旋混勻,于室溫10,000×g離心10分鐘,收集沉淀,重復(fù)該步驟兩次；用于去除減少土壤中各種離子、無機(jī)物以及有機(jī)物,胞外游離的蛋白；所述的離子為：鈣離子、鋁離子、鎂離子、鐵離子、鎂離子、鉀離子；所述的無機(jī)物為：硫酸鋁、硫酸鎂、硫化亞鐵、硫酸錳、碳酸鈣、堿金屬；所述的有機(jī)物為：富理酸、胡敏酸、胡敏素、鼠類、鳥類、水稻、小麥、黑麥草、玉米根系、樹木細(xì)根和粗根系及水稻、小麥、黑麥草、玉米落葉和樹木的落枝；所述的土壤離子去除劑為：50毫摩爾/升的三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽緩沖溶液,20毫摩爾/升的乙二胺四乙酸,100?毫摩爾/升的氯化鈉,0.01?克/毫升的聚乙烯吡咯烷酮,pH10.0；c、?加5倍體積預(yù)冷的磷酸緩沖液,0.01M,pH?7.4,渦旋混勻,于室溫10,000×g離心10分鐘,收集沉淀,重復(fù)該步驟兩次；用于平衡滲透壓、維持離子強(qiáng)度和pH7.4；d、加5倍體積的無菌超凈水,渦旋混勻,于室溫10,000×g離心10分鐘,收集沉淀；用于洗滌沉淀并主要去除無機(jī)鹽離子；e、沉淀通過冷凍干燥后獲得無雜質(zhì)的土樣凍干粉,置于?70℃?zhèn)溆茫?/div>

　　B、土壤微生物蛋白提�。篴、稱取2.0克上述預(yù)處理后的冷凍干燥樣品于10毫升預(yù)冷無菌離心管中,加6mL?細(xì)胞樣品蛋白提取液,渦旋混勻,每個樣品3次重復(fù)；所述的細(xì)胞樣品提取液配比為：100毫摩爾/升的三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽緩沖溶液,1毫摩爾/升的二硫蘇糖醇,pH?7.8,100微升2.0微克/毫升的蛋白酶抑制劑；b、置于冰浴中用超聲波法徹底破碎細(xì)胞；20000×g,4℃下離心15分鐘,收集上清液,重復(fù)離心操作一次,所有的蛋白液均被收集,加入質(zhì)量比為80%的固體硫酸銨溶解度后,置于4℃振蕩充分混勻,20000×g,4℃下離心20分鐘,收集析出的蛋白,加50微升的1,5–二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶溶解液溶解后,獲得土壤微生物蛋白后,置于0℃保存待用；所述的1,5–二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶溶解液配比為：100毫摩爾/升pH?7.8的三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽緩沖溶液和1毫摩爾/升的的二硫蘇糖醇；

　　C、土壤1,5–二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶酶活性測定：測定前將土壤微生物蛋白提取溶液置于30℃水浴中20~30分鐘以恢復(fù)酶活性,測定時環(huán)境溫度保持30℃,每個樣品酶活性測定三次,同時做兩個陰性對照,分別為無反應(yīng)底物1,5?二磷酸核酮糖對照和熱變性細(xì)胞蛋白提取物對照,1,5–二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶活性以二磷酸核酮糖羧化酶的酶活力大小來表示；a、將配制好的反應(yīng)體系搖勻,倒入比色杯內(nèi),以蒸餾水為空白,在紫外分光光度計上340?nm處反應(yīng)體系的吸光度作為零點(diǎn)值,將50微升1,5–二磷酸核酮糖加于比色杯內(nèi),并計時,每隔30秒測一次吸光度,共測3分鐘,以計時起到第1分鐘內(nèi)吸光度下降的絕對值計算酶活力；b、不加1,5?二磷酸核酮糖的對照,對照的反應(yīng)體系與上述酶反應(yīng)體系完全相同,不同之處只是把酶提取液放在最后加,加后計時并測定此反應(yīng)體系在340nm處的吸光度,記錄前1分鐘內(nèi)吸光度的變化量,計算酶活力時應(yīng)減去這一變化量；c、二磷酸核酮糖羧化酶的酶活力的計算：nmol?CO2?kg?1(?土壤)?min?1＝ΔA×N×C?/(6.22×2dΔt)式中：ΔA－反應(yīng)最初1min內(nèi)340nm處吸光度變化的絕對值；N－稀釋倍數(shù)；C－換算系數(shù)；6.22－每微摩爾的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸在340?nm處的吸光系數(shù)；2－每固定1摩爾CO2有2摩爾的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸被氧化；d－比色光程；kg?1－每千克預(yù)處理后土樣凍干粉；Δt－測定時間為1分鐘。